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Vectores de expresión genómica de ADN para los estudios genéticos moleculares funcionales en el ataxia de Friedreich en las células neuronales in vitro e in vivo. |
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Michele MP Lufino1, Javier Alegre-Abarrategui1, Filip Lim2 y
Richard Wade-Martins1. El Ataxia de Friedreich (FA) es el ataxia hereditario más común y está causado por una expansión anormal de la repetición GAA en el intron 1 del gen de FRDA que produce una reducción de niveles de la proteína mitocondrial frataxina (FXN). La falta de modelos neuronales adecuados para el estudio del estado natural y de las formas deformadas de frataxina ha dificultado la comprensión de su función y el desarrollo de aplicaciones terapéuticas. Describimos aquí nuestro trabajo que desarrolla la tecnología del cromosoma artificial bacteriano infeccioso (iBAC), basado en el vector amplicon del virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1), como parte de un nuevo modelo mejorado para el análisis de la expresión del tipo natural y del locus de FRDA mutante en las células neuronales. Hemos construido previamente el iBAC-FRDA un vector de expresión genómica de ADN que expresa los 135 kb del locus completo del gen FRDA, y hemos demostrado la expresión y la complementación funcional de la deficiencia de FRDA en los fibroblastos de los pacientes de FA. Hemos desarrollado ahora el iBAC-FRDA-Luciferasa, un vector genomico de ADN-fusión que nos ayuda a entender bien la regulación de expresión de FRDA en estado natural y del locus mutante. Usando la recombinación homóloga, nosotros insertamos la sucesión de luciferasa correctamente a los 3 ' del último exon del gen de FRDA (exon 5a). En las siguientes fases de recombinación homóloga nosotros introdujimos en el intrón una repetición amplificada 1 ~310 GAA de ADN del paciente. La entrada del vector iBAC en la línea celular neuronal SH-SY5Y que usó el sistema amplicon HSV-1 permitió una alta trasducción de esta línea celular por otra parte muy resistente a los procedimientos del transfección Demostramos la expresión y el descubrimiento de la proteína de fusión FXN-luciferase¡a en SH-SY5Y y, lo más importante, nosotros mostramos que la presencia de repetición GAA en el iBAC-FRDA-Luciferasa induce la represión de expresión de frataxina en un 75%, lo que nos explica la inhibición de transcripción observada en las células de pacientes con FA. La validación de este modelo vino de experimentos preliminares que mostraron que la incubación con inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC) pueden relevar la represión generada por la repetición expandida de GAA, qué se cree que induce la formación de heterocromatina. Las técnicas actuales para el descubrimiento de frataxina son
laboriosas, basadas en RT-PCR y en técnicas western blot. El nuevo
vector iBAC-FRDA- Luciferasa descrito aquí representa una nueva
herramienta para el estudio de FA, pues perrmite un análisis
cuantitativo rápido de la expresión de FXN en condiciones diferentes (
in vitro e in vivo). Este vector facilitará el estudio de la función de
la frataxina y ayudará a desentrañar el complejo mecanismo por el cual
las expansiones del triplete GAA inducen a la supresión de expresión de
FXN. El uso de iBAC-FRDA-Luciferasa también podría proporcionar una
plataforma para probar nuevos fármacos capaces de restaurar la expresión
del frataxina. Finalmente la inyección en el cerebro del ratón puede dar
la visión del transporte de FXN y de su expresión en animales vivos,
dándonos así una información importante para las aplicaciones de futuras
terapias génicas. En conjunto, el trabajo representa una aplicación
poderosa y única con una capacidad trasgénica muy alta (~150 kb) del
sistema HSV-1 amplicón. |
